克隆猴 为什么会诞生在中国？-z6尊龙旗舰厅
阅读提示：2012年，体细胞重编程技术获得诺贝尔生理学或医学奖。就在那一年，蒲慕明和同事们在浙江乌镇举行的非人灵长类研究小型专题研讨会上提出：再难也要把体细胞克隆猴做出来!
记者｜陈 冰
2017年11月27日，世界上首只体细胞克隆猴“中中”在中国诞生，紧接着，10天之后，第二只克隆猴“华华”又顺利诞生。1月25日，由位于上海的中国科学院神经科学研究所蒲慕明、孙强领导的研究团队在国际权威学术期刊《细胞》上发表论文，宣布了这一令世界震惊的成果。
从1996年第一只克隆羊“多莉”诞生以来，21年间，各国科学家利用体细胞先后克隆了牛、鼠、猫、狗等动物，但一直没有跨越与人类最相近的非人灵长类动物的“屏障”。
“全世界的神经科学家和药企都在期盼它们的出现。”中国科学院院士、神经所所长蒲慕明说，脑科学发展到今天，小鼠的大脑与人脑的区别太大，已无法胜任很多实验任务，无论是新药研发还是科学研究，都需要发展出更接近人类的非人灵长类模式动物。
体细胞克隆猴的成功，标志着最接近人类的灵长类动物——猴子将成为了人类疾病的动物模型，它将为脑疾病、免疫缺陷、肿瘤、代谢等疾病的机理研究、干预、诊治带来前所未有的光明前景。“这是世界生命科学领域近年来的重大突破。”蒲慕明院士说。
克隆猴为什么难？它的诞生有什么价值？它为什么又会诞生在中国呢？
中国式攻关
截至目前，同为雌性的克隆猴“中中”和“华华”已经在恒温箱里茁壮成长了两个月，在科研人员24小时的精心呵护下，它们的各项身体指标均很正常，发育状态良好。除了体形大小略有差异，姐妹俩看不出什么区别。喝奶粉、玩娃娃、互相打闹，它们的萌表情吸引了全世界的目光。
其实，“中中”和“华华”并不是世界上诞生的第一只克隆猴。早在2000年，美国俄勒冈灵长类动物研究中心就通过胚胎分裂法克隆了猕猴tetra。这种克隆方法不同于科学家们常用的体细胞核移植技术，而是把多个猴胚胎（107个）进行分裂，然后对胚胎进行移植，结果有4个能够发育，最终只有tetra在胚胎分裂157天之后幸运地降生。不过这种克隆方法并没有得到学术界较大关注，因为它与一般意义上的体细胞克隆技术有较大差别，技术难度也不在一个层次上。
体细胞是一个相对于生殖细胞的概念。它是一类细胞，其遗传信息不会像生殖细胞那样遗传给下一代。(20).jpg)
“体细胞是执行特殊功能的，比如红细胞是执行运氧功能的，免疫细胞是执行免疫防御功能的，它们不具有发育的特性。但有部分体细胞可以在体外进行培养实现无限增殖，可以拿到无数的体细胞。”中科院神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强说。
利用这个特点，体细胞克隆技术应运而生。体细胞克隆技术又可称体细胞核移植技术。首先，需要把动物体细胞分离培养，然后再采用核移植的方法，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔。
此次“中中“和“华华”的基因，都来自同一个流产的雌性猕猴胎儿。科研人员提取了这个猕猴胎儿的体细胞（非生殖细胞），通过技术手段将其细胞核“植入”若干个“摘除”了细胞核的卵母细胞。然后再通过代孕猴子孕育出“中中“和“华华”这两只食蟹猴。
以往用普通的猴子做实验动物模型，存在两个劣势。
“一是猴子的繁殖力低，传代时间长。一个猴子的怀孕周期是160天，从一个小猴子出生到性成熟可以怀孕生育至少要等4年到6年时间。而建立一个基因体系的模式动物需要繁殖近20代，相当于要花费百年时间，谁也等不起。改用体细胞来繁殖，猴子的繁殖周期可以缩短到8至10个月。二是遗传背景复杂。因为猴子的父亲母亲都不一样，其基因来源不一样，遗传背景就不一样，这样个体差异大，对实验干扰就会比较大。”孙强说。
基于此，一直以来世界各国的科研人员都在想办法攻克这个难题。世界上很多优秀的生命科学实验室都尝试过，很多连囊胚都很难获得。2003年，权威学术期刊《科学》发表了一篇美国匹兹堡大学医学院研究人员的论文，论文称，用现有技术克隆灵长类动物“是行不通的”。
最接近成功的一次实验发生在2010年。美国俄勒冈灵长类研究中心的著名科学家米塔利波夫率领团队成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎发育至81天，以流产告终。
2012年，体细胞重编程技术获得诺贝尔生理学或医学奖。就在那一年，蒲慕明和同事们在浙江乌镇举行的非人灵长类研究小型专题研讨会上提出：再难也要把体细胞克隆猴做出来!
当蒲慕明将攻克体细胞克隆猴的任务交给孙强时，孙强认为成功的希望并不大，但他还是接下这个“不可能的任务”，开始了艰难探索。让人惊叹的是，这对取得重大科学突破的师生——孙强和刘真，都是从未喝过“洋墨水”的本土人才。
当时，刘真还只是一名二年级的硕士研究生。2016年，刘真博士毕业时，已经因自闭症猴子的研究，在英国《自然》杂志上发表过一篇论文。原本，以这样的条件，申请世界上任何一个一流实验室的博士后，他都可以顺利成行。而刘真却决定留在神经所位于苏州西山的非人灵长类研究平台，与导师孙强一起挑战这个世界级难题。
蒲慕明说，刘真做了一个正确的选择。因为他去再好的实验室，它们都不会把一个风险如此巨大的课题，交给一个初来乍到的博士后去做。不过，为了让刘真能够安心留下，神经所特事特办，给了他超出一般博士后的优厚待遇。蒲慕明认为，体细胞克隆猴5年攻关成功的关键，就在于孙强领导了一支精诚合作、刻苦耐劳、坚持不懈的团队。
为此，蒲慕明特别呼吁国家在“青年千人”计划之外，制定相应的人才政策吸引本土优秀青年留在国内做研究。他说，现在优秀的博士生总希望能够去国外优秀实验室，然后作为“青年千人”被引进回国，这样就能获得更好的学术地位和待遇，而这等于让优秀青年科研人才将生命中最旺盛的创新精力发挥在了祖国之外。
“为什么我们不能让他们留在国内呢？我敢说，如果没有中国留学生，美国很多实验室的创新活力都将打折。”蒲慕明说，中国的科研条件已经不比国外差，是时候调整人才政策，吸引更多优秀的青年科学家留在国内做博士后，把他们的“最强创造力”用在中国创新上。
梳理孙强团队在《细胞》杂志上的论文细节，我们可以看到团队其实是尝试了两种体细胞。一种是猴胎儿成纤维细胞，另一种是猴卵丘细胞（位于卵丘的卵泡细胞）。利用猴胎儿成纤维细胞的一组中，研究人员将获得的79个克隆胚胎（处于2细胞至囊胚期）移植入21只代孕母猴中，最终有6只代孕母猴成功怀孕，共携带5个胎儿（有一个怀孕的是双胞胎），另外两只仅携带了孕囊（gestational sacs）。4只代孕成功的母猴有两只流产，剩下两只正常怀孕超过140天，然后通过剖腹产手段获得两只存活的幸运克隆猴“中中”和“华华”。
而利用猴卵丘细胞的一组中，最终有两只胎儿发育超过了130天，通过剖腹产手术出生后不久就死亡了（分别在出生3小时和30小时后死亡）。
可以说，“中中”和“华华”的顺利诞生、健康成长离不开科研人员、兽医、护理员无微不至的照料。“团队成员照顾一只猴子，真的就跟照顾一个孩子似的。”
给猴子接生，相当于给人类婴儿接生，工作量一点也不小。为了不让任何一只如国宝般珍贵的体细胞克隆猴幼崽临产夭折，科研人员们更是24小时不间断地轮流观察，并发明了独特的微信“打卡”法，每半小时向主管报告一次，以保证观测员的清醒状态。一位科研人员发朋友圈说，晚上睡觉最怕听到电话铃响，“这意味着猴子们又出状况了。”孙强说，那里条件十分艰苦，十几个人轮流买菜做饭，忙起来连春节也不能回家。
正是科研团队通过5年的不断攻关，呕心沥血，在经历了无数次失败和许多方法的改进之后，才最终获得成功。
克隆猴子到底有多难？
早在1999年，时任中国科学院院长路甬祥即邀请国际神经科学界的著名科学家蒲慕明回国，组建与国际接轨的全新科研机构——中国科学院神经科学研究所。蒲慕明说，神经所近年来在世界上的确已经相当有名，但要成为神经科学领域的领跑者，必须要有不断产生重大突破的持续创新力。
何为重大突破？开创新的研究领域，或者在现有领域中取得里程碑式的成果——世界顶尖的科研机构都是如此。每个科研领域都有众所周知的重大未解难题，能在一个领域不断产生重大突破，才是该领域的领跑者。在蒲慕明看来，孙强团队的体细胞克隆猴成果就是生命科学领域内的一次重大突破。它标志着一个崭新时代的诞生：几年后，一大群具有相同遗传背景的实验猴，将成为生命科学实验和新药研发的人类新替身。
孙强团队经过5年的研究分析认为，体细胞克隆的关键节点主要分为四个阶段：胚胎构建、激活、核基因启动，以及着床后发育。其中，前三个阶段，也就是胚胎细胞从一个细胞依次分裂成2、4、8个细胞的过程是最关键的。
孙强介绍，克隆猴主要有三个难点。难点之一是细胞核不易识别，“去核”难度大。作为受体的卵母细胞，必须先把细胞核“摘除”，才能容纳体细胞的细胞核这个“外来户”。但是，猴的卵母细胞核去核难度非常大。
孙强团队中，博士后刘真是“去核”的主要操作者。为了能在去核过程中以最短时间内、用最小损耗完成“去核”工作，减少对卵母细胞的损害，刘真苦练一年半技术，经过“千锤百炼”，如今的他可以在闪烁的偏振光源下，只用52秒就能以极小的损伤为6个卵母细胞去核，还能在15秒内将体细胞的细胞核移植到卵母细胞内——这项技术上，他绝对算得上世界冠军。
难点之二，是卵细胞容易提前激活。克隆过程中，体细胞的细胞核进入卵细胞时，需先“唤醒”卵细胞，然后才启动一系列发育“程序”。因此，“唤醒”的时机要求非常精准。但是，使用传统方式，猴的卵细胞很容易被提前“唤醒”，往往导致克隆“程序”无法正常启动。只要操作上稍一不小心，卵母细胞就可能被激活，然后它就会先开始自主卵裂，体细胞就跟不上了，最后导致这个卵无法发育。
难点之三，是体细胞克隆胚胎的发育效率低。被转移到卵细胞里的细胞核，突然要扮演受精卵的角色，“赶鸭子上架”很不适应，需要科学家采取多种手段“保驾护航”。如果“保驾”不力，绝大多数克隆胚胎都难以正常发育，往往胎死腹中。
为此，团队成员除了进行猴体细胞核移植技术的训练之外，还通过不断尝试优化体细胞克隆胚胎的激活和培养体系。“同行的研究揭示了胚胎早期组蛋白修饰对胚胎发育至关重要，去乙酰化酶抑制剂tsa和组蛋白去甲基化酶kdm家族能有效提高克隆胚胎的囊胚发育率。”孙强说，“我们在食蟹猴体细胞核移植体系中找到了tsa和kdm4d的理想浓度组合，囊胚率一下子提高到46%，优质率也从7%提升到30%。并且利用卵丘颗粒细胞和成纤维细胞为供体做了大量的实验，终于实现了一个最重要物种的克隆。”
通过dna指纹鉴定，“中中”和“华华”的核基因组信息与体细胞供体完全一致，证明姐妹俩都是正宗的克隆猴。
孙强表示，此次6只猴子代孕，生出2个克隆猴子，基本上达到了自然繁殖率的一半水平。未来要在目前取得成功的基础上，着力提高效率，以满足实际应用需求。
克隆猴已经诞生，那么是否意味着克隆人离我们已经不远了呢？蒲慕明与孙强很坚定地说了“不”。蒲慕明介绍，体细胞克隆猴技术的突破，表明理论上克隆人的技术障碍基本去除，但是做克隆猴的目的完全是为了建立动物模型来帮助治疗人类的各种疾病，不仅没有必要进行克隆人的研究，而社会的伦理道德也不允许克隆人。
模型动物的巨大价值
“克隆猴的诞生意味着中国将率先建立起可有效模拟人类疾病的动物模型。”孙强说，这既能满足脑疾病和脑高级认知功能研究的迫切需要，又可广泛应用于新药测试。
孙强介绍，如果实验对象的遗传背景不同，“实验组”和“对照组”的说服力就不够强。传统医药实验大量采用小鼠，很大程度上是因为鼠类可通过快速近亲繁殖，培育出大量非常相似的小鼠。
但由于小鼠和人类相差太远，针对小鼠研发的药物在人体检测时大都无效或有副作用。据了解，这是目前绝大多数脑疾病研究无法取得突破的一个主要原因。
谈到体细胞克隆猴构建成功的意义，蒲慕明表示，首先证实了猕猴可以用体细胞来克隆，二是猕猴可以成为真正有用的动物模型。
“克隆猴遗传背景相同，可以减少个体间差异对实验的干扰，大大减少了实验动物使用数量。同时，通过体细胞克隆技术，模型猴制备时间缩短到一年内，复杂和精准的基因编辑可以在体外培养的细胞进行。”蒲慕明说。
此外，体细胞克隆猴的成功，将推动我国率先发展出基于非人灵长类疾病动物模型的全新医药研发产业链，促进针对阿尔茨海默病、自闭症等脑疾病，以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。
美国的杰克森实验室建立于1929年，是世界上最大的模式动物研发基地和销售公司，为国际生物医学界培养并出售7000多种基因编辑小鼠品系。“等这项技术成熟后，未来，我国也可建成以非人灵长类为模型的主要研发基地和产业链。”蒲慕明说：“以我国科学家为主导的灵长类全脑图谱计划的实施和灵长类脑科学的前沿研究，将进一步使我国成为世界脑科学人才的汇聚高地。”
链接:中国科学家的克隆研究之旅
上世纪60年代，童第周先生率先在国内开展鱼类核移植研究。童第周等在1963年出版的《科学通报》上发表题为《鱼类细胞核移植》的论文（英文论文发表于1965年的《科学通报》）。童第周先生于1979年3月逝世，由他撰写的论文《鲤鱼细胞核和鲫鱼细胞质配合而成的核质杂种鱼》，以中英文发表在1980年的《中国科学》上，论文报道了中国成功获得具有“发育全能性”克隆鱼的成果。这是世界上报道的第一例发育成熟的异种间的胚胎细胞克隆动物。
1990年，西北农业大学（现为西北农林科技大学）张涌成培育出了胚胎克隆山羊。
1992年，江苏省农科院获得胚胎细胞克隆兔；
1995年，广西农大石德顺等与华南师大合作获得胚胎细胞克隆牛。
1999年前后，扬州大学与中科院遗传发育所合作完成体细胞克隆羊“淼淼”。
2002年，中科院动物所陈大元研究员与山东中大动物胚胎工程中心合作成功获得了一批成体细胞克隆牛。
2005年，中国农业大学李宁院士领导完成成体细胞克隆猪。（整理/陈冰）